Tinción de Gram con Bacilos Gram (-)

Las enterobacterias son bacilos cortos gram negativos no esporulados, que pueden o no tener motilidad. Son anaerobios facultativos o anaeróbicos.
 

Medio de agar MacConkey

Medio selectivo por contener sales biliares y violeta cristal que inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas. También es un medio diferencial porque contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).
Las bacterias capaces de fermentar lactosa producirán un cambio en el pH del medio por liberación de productos ácidos. Como consecuencia sus colonias aparecerán de color fucsia/violeta, contrastando con la coloración amarillenta de las colonias incapaces de fermentar la lactosa.
 

Medio de agar SS

Medio de cultivo selectivo para Salmonella y Shigella. Está compuesto por sales biliares que inhiben el crecimiento de coliformes, lactosa y rojo neutro (indicador de pH).
Las colonias fermentadoras de lactosa producirán ácidos y cambiará el color del medio a rosa. Como Shigella y Salmonella no utilizan este azúcar forman colonias transparentes.
El tiosulfato es la fuente de azufre para la producción de ácido sulfhídrico de las bacterias sulfato-reductoras. Este ácido reacciona con la sal de hierro y se forma sulfuro de hierro de color negro. Las colonias de Salmonella se observan transparentes con un precipitado negro en el centro.

Medio de agar EMB (eosin methylene blue)

Contiene sucrosa y lactosa.
Utiliza como inhibidor e indicador a eosina azul de metileno.
Prueba negativa si se mantiene igual color al medio (rojo), indicativo de la no fermentación de azúcares.
Escherichia coli produce un color verde metálico característico para esta prueba positiva.

Medio con citrato de Simmons

Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y azul de bromotimol como como indicador de pH.
Únicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrán multiplicarse en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos) que junto con la eliminación de citrato (ácido) generará una fuerte basificación del medio que será aparente con un cambio de color del indicador de pH de verde a azul.

Prueba de urea

El indicador de pH utilizado es el rojo fenol.
Esta prueba detecta la presencia de la enzima ureasa en el metabolismo bacteriano, la cual al hidrolizar urea forma productos amoniaco que alcalinizan el medio y se evidencia con el cambio de color del medio desde un amarillo pálido hasta un rojo fucsia.

Prueba SIM (sulfuro indol motilidad)

La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol. Al añadir al medio SIM el reactivo de Kovacks o de Erlich que contiene p-dimetilaminobenzaldehído, reacciona tanto con el indol como con el triptófano produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la interferencia del triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el alcohol y sólo este compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado característico de esta prueba.

Medio con TSI (triple sugar iron)

Medio diferencial complejo (de color rojo) compuesto por 3 azúcares: 10% lactosa, 10% sucrosa y 1% dextrosa y un ligador que es en este caso el hierro. La siembra se realiza tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de éste (anaerobiosis).
Medio K (alcalino) de color rojo. Medio A (ácido) de color amarillo.
K/A
Si la bacteria metaboliza sólo la glucosa: en la superficie la utilizará por vía respiratoria, y donde la tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará una pequeña proporción por vía fermentativa. Esto generará una pequeña cantidad de ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas de la decarboxilación oxidativa de las proteínas.
Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber cambiado de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearán desde el primer momento la glucosa por vía fermentativa, generando ácidos que no serán neutralizados, provocándose un descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiará a amarillo.
A/A
Si la bacteria, además fermenta lactosa: los ácidos producidos modificarán también el pH de la superficie del medio. Las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de ácidos producidos en esta fermentación, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentración que la glucosa. El color del medio en la superficie cambiará a amarillo.
K/K
Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanece de color rojo. Los azúcares son respirados, degradándose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH.
A/A(g)
aparición de burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo.
K/A(H2S)
aparición de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras anoxobiónticas son capaces de emplear el tiosulfato sódio como aceptor final de electrones en la cadena transportadora. Este compuesto se reduce a ácido sulhídrico que reacciona con el hierro Fe2+ presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro.

Prueba de fermentación de azúcares

Medio MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer)

Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en 2 fases:
1. Metabolismo aeróbico (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio
2. Metabolismo anaeróbico (fermentación) que puede ser de 2 tipos dependiendo de los productos finales obtenidos:

     2.1 fermentación ácido-mixta: productos finales son ácidos orgánicos (fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol
     2.2 fermentación butilén glicólica: productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario.

La liberación de ácidos orgánicos  generará un acusado descenso del pH que podrá ser detectado añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo (rojo a pH 4.0).
Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce acetoína puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionarán con este compuesto produciendo rojo característico.

Prueba de fenilalanina

En este medio, el aminoácido presente es la fenilalanina, empleado para determinar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa en bacterias.
La acción de esta enzima se evidencia por la aparición en el medio del producto resultado (ácido fenilpirúvico) que se detecta mediante adición de cloruro férrico, resultando un compuesto de coloración verde oscuro.

 

Prueba de oxidasa

Se basa en la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio de oxidarse al ceder electrones al citocromo c en su presencia, produciendo formas coloreadas (azul/morado). Permite diferenciar el grupo Enterobacteriaceae (que carecen de citocromo c) del género Pseudomonas (que posee citocromo c).

Sistema API para enterobacterias

Sistema que permite obtener todos los resultados de las mismas pruebas realizadas arriba, de manera simultánea, rápida y con una menor cantidad de muestras y reactivos.